חקר המיקרוביום – איך זה עובד

בפוסט הקודם למדנו מהם מיקרוביום, מיקרוביוטא, ומטא-גנום.
בקצה המזלג למדנו את שיטות הריצוף Shotgun sequencing וריצוף מכוון, וראינו שעל מנת לקבל מידע שהוא הרבה יותר רלוונטי לשלב ראשוני של המחקר אנחנו צריכים לרצף בשיטת ריצוף מכוון רצף שמכיל גם אזורים שמורים וגם אזורים שאינם שמורים, כך שהמידע שנקבל יכיל בוודאות את החיידקים שאנחנו מחפשים ובאותו מידע מאותו גן נוכל להבחין בין חיידק לחיידק.
ומכוון שכך הRNA הריבוזומלי הוא אחד מהגנים הכי נפוצים המשמשים לאפיון המקרוביום.

בפוסט זה נסביר למה RNA ריבוזומלי כל כך נפוץ בחקר המקרוביום?
נדבר על האזורים החשובים של 16S ואיך הם משפיעים על המידע המשמש אותנו לחקר המקרוביום.

כנתון התחלתי בדרך כלל המצב הוא שיש לנו דוגמאות שנאספו ממקורות שונים המכילות חיידקים מסוגים שונים ולכל חיידק גן משלו.
כפי שראינו, ישנן כמה דרכים לריצוף, אחת מהן היא Shotgun Sequencing -ריצוף כל הגנום, בשיטה הזו אנחנו נקבל כמות גדולה של גנים בגודל של כ-100-200 בסיסים ומקור כל אחד מהגנים הללו יכול להיות מכל חיידק או מגן שונה מאותו חיידק ואי אפשר להשוות ביניהם, כך שלעת עתה השיטה אינה אפקטיבית. אנחנו רוצים גן שיהווה בסיס לכל החיידקים, וניתן יהיה להשוות על פי אותו בסיס בין חיידק לחיידק.
ולכן השיטה היותר אפקטיבית תהיה השיטה השניה- ריצוף מכוון.
כרגע מה שנותר לנו הוא לרצף גן שיהיה משותף לכל החיידקים.
השאלה היא איזה גן?
ובכן, מדענים ישבו וחשבו איזה גן משותף לכל החיידקים? למעשה השאלה הרבה יותר רחבה, איזה גן משותף לכל היצורים החיים?
חשבו, חקרו ומצאו. הריבוזום.

16S ריבוזומלי
התאוריה הבסיסית עליה מבוססת הביולוגיה עליה היא שה-DNA מקודד ל-RNA וה-RNA מקודד לחלבונים.

למעשה ה-RNA יכול לפעול על עצמו, כלומר הוא בעצמו יכול להוות מכשיר שפועל על מולקולות RNA אחרות.
הריבוזום הוא מכשיר המורכב ממולקולת RNA ותפקידו הוא להעביר דרכו מולקולות RNA שיוצאים מגרעין התא ולתרגם אותן לחומצות אמינו שייצרו בסופו של התהליך חלבונים.

המולקולה הספציפית הזו שאנו קוראים לה rRNA (רנא ריבוזומאלי) (בניגוד ל-mRNA שאותו מתרגמים) לעולם לא תתורגם לחלבון, ברגע שהיא יוצאת מהגרעין היא יוצרת מבנה שלישוני.
תהליך ייצור החלבון הוא מאד בסיסי בכל האורגניזמים והריבוזום נשאר שמור מאד ולכן כל אחד מהגנים של הריבוזום יכול להיות מטרה לריצוף, כולם שמורים.

ההתמקדות שלנו בחקר המיקרוביום היא בעיקר על תת יחידה של הריבוזום הנקראת 16S. (האות S מייצגת יחידת זמן הנקראת Svedberg איתה מדדו את זמן השיקוע של המולקולה כדי להעריך את משקלה) תת היחידה 16S מכילה כ-1500 בסיסים, חלקם מאד חשובים לתפקוד תקין של הריבוזום וחלקם פחות.

בגרף העליון: גן ה-16S , אחוזי השונות והשימור שלהם. בגרף התחתון: זוגות שונים של פריימרים.

לפיכך, אם בוחנים את כל אורך גן ה-16S הריבוזומלי מהעמדה הראשונה (אפס) עד לעמדה האחרונה (בערך 1500) ונבנה גרף שציר ה-Y שלו יהיה אחוז החיידקים המכילים את אותו DNA נבחין שישנם אזורים בהם יש לנקלאוטידים (בסיסים) נטייה להיות מאד שמורים, ואזורים אחרים שבהם מוטציות יכולות להתרחש ובכל זאת לשמר את הפעילות של הריבוזום, נקרא להם אזורים ווריאבילים (משתנים).
כמובן שאם חיידק מסוים מסיבה כלשהי יעבור מוטציה בחלק השמור הוא פשוט לא ישרוד.
בהמשך נרחיב על הגן הספציפי הזה ולמה הוא מכיל את התכונות הללו.

הגן כולו ארוך מידי למכשירי הריצוף, לכן אנחנו רוצים למצוא חלק מכל הגן שיכיל כמה מאות נוקלאוטידים שיוכלו לספק לנו את המידע על איזה זנים של חיידקים נמצאים בדוגמה.
אנחנו לא רוצים לקחת רק מקטע של של DNA שמור מכוון שאז לא נקבל שום מידע, הוא יהיה זהה לכל החיידקים.
מצד שני אם נבחר אזור יותר מדי וריאבילי, יכול להיות שיהיו יותר מדי שינויים גם אצל חיידקים מאותה משפחה, מה שלא יספק לנו את האינפומציה הנדרשת.
לכן נרצה לבחור מקטע שמכיל גם את האזור השמור וגם את האזור הוריאבילי.
כדי שהשיטה הזו תעבוד, הדבר השני שאנחנו רוצים הוא דרך ל"דוג" את מקטע הDNA שאנחנו רוצים וליצור ממנו כמה שיותר העתקים ואותם (ורק אותם) לשלוח לריצוף.

פריימרים:

הרצף שנמצא בשימוש הכי נפוץ הוא האזור V4 שהוא האזור הוריאבילי שאיתו נשווה בין חיידק לחיידק.
אז נניח שאנחנו רוצים לרצף את המקטע V4, זה אומר שאנחנו צריכים רצף DNA קצר שמתאים לחלק ההתחלתי של V4 ועוד רצף DNA קצר שיתאים לחלק הסופי שלו אבל הבעיה היא שהוא משתנה מחיידק לחיידק. לכן על ידי שימוש בפריימרים שמתאימים לאזור השמור ונמצאים משני צדי האזור הוריאבילי אפשר 'לדוג' את האזורים הרצויים.
הפריימרים הם פשוט רצפים מאד קצרים של DNA בערך 12-15 בסיסים שמיוצרים באופן מלאכותי לפי הזמנה ונמצאים בשימוש רחב למטרות שונות.
מה שאנחנו עושים בפועל הוא: לוקחים את הפריימרים ואת ה-DNA שלנו, מערבבים אותם ומכניסים למכשיר PCR, עם האנזים DNA פולימראז שתפקידו העיקרי הוא להשלים את גדיל ה-DNA הנמצא במצב של חד-גדיל, לדו-גדיל על ידי הוספת נקלאוטידים בין האזורים שבו הפריימרים מתחברים. מכשיר ה-PCR משכפל את הרצפים על ידי כך שכל רצף שמתאים לפריימרים משוכפל באופן אקספוננציאלי.
בסופו של דבר נקבל המון (בערך 10 מליון) העתקים של אותו מקטע DNA מחיידקים שונים כאשר כמות הרצפים שרצינו תהיה גדולה הרבה יותר משאר הרצפים באופן כזה שהסיגנל שלו יאפיל על הרצפים הלא רצויים.

אם יש לכם הערות, הארות, שאלות, פידבקים על התוכן או על איך שהאתר נראה, רעיונות,

אתם יותר ממוזמנים ליצור קשר🔗:

bioinformatics.israel@gmail.com

השאר תגובה

האימייל לא יוצג באתר. שדות החובה מסומנים *